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AG Tieftemperaturanwendungen / Kryotechnik

Kryokonservierung ist eine Technologie, die die Langzeithaltbarmachung von verschiedenen Zelltypen, natürlichen und künstlich hergestellten dreidimensionalen Geweben bei extrem tiefen Temperaturen ermöglicht. Es besteht ein Bedarf an alternativen Kryokonservierungsstrategien, da die weit verbreiteten Kryoprotektiva (CPAs) wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid (DMSO) abhängig von Zeit, Temperatur und Konzentration zytotoxisch wirken. Dies führt sowohl zu einer verminderten Vitalität und Funktionalität als auch zur genetischen und epigenetischen Instabilität der Zellen nach dem Auftauen. Ein weiteres Forschungsgebiet der Biokältetechnik ist die Lagerung von künstlich hergestellten dreidimensionalen Geweben. Aktuelle Fortschritte im Tissue Engineering, Zell- und Organtransplantation und Entwicklung von Schutzmethoden wie Einbetten oder Einkapseln eröffnen vielversprechende Möglichkeiten zur Lagerung und zum Transport von Stammzellen und therapeutischen Produkten.

Somit sind die Hauptthemen der Forschungsgruppe Tieftemperaturanwendungen / Kryotechnologie (FTAK) die Folgenden:

  • Entwicklung und Testung von Geräten und Methoden für effizientes Einfrieren und Auftauen von Zellen, natürlichen und künstlich hergestellten dreidimensionalen Geweben
  • Anwendung der induzierten Eisbildung, um die Nukleationstemperatur zu kontrollieren
  • Entwicklung von sicheren Einfrierprotokollen, inklusive der Anwendung von ungiftigen Kryoprotektiva (CPAs) und der Analyse von Zellviabilität und –funktionalität
  • Physikalische und biologische Aspekte der Kryokonservierung inklusive Wärme- und Massentransport
  • Kryokonservierung von Blut

Die FTAK ist ebenfalls präsent in dem neu eingerichteten Niedersächsischen Zentrum für Biomedizintechnik, Implantatforschung und Entwicklung (NIFE).

 Gruppenmitglieder

 

 

Geräte und Methoden zum effizienten Einfrieren und Auftauen

Da das Ergebnis der Kryokonservierung zelltypabhängig ist, müssen die Hauptparameter für das Einfrieren und Auftauen für jeden Zelltyp und jedes Gewebe optimiert werden. Zu den verfügbaren Methoden gehören sowohl das direkte Beobachten von Einfrier-/ Auftauvorgängen sowie die Betrachtung der induzierten Eisbildung unter dem Kryomikroskop.

  • Kryomikroskop mit LINKAM Cryostage
  • Einfrierapparate mit kontrollierten Kühlraten:

    • kommerziell (Asymptote VIA Freeze Research, Planer Kryo 560-16, Askion Workbench C-Line WB230, CM2000)
    • entwickelt am Institut (IMP)

  • Auftauapparat
  • Gefriertrocknung
  • Gerichtete Erstarrung, Bridgman

 

 

Induzierte Eisbildung

Die Eisbildungstemperatur ist ein Schlüsselparameter, welcher das Ergebnis der Kryokonservierung beeinflusst. In dieser Hinsicht arbeiten wir auch an der Entwicklung und Anwendung der folgenden Techniken zu strengen Kontrolle der Eisnukleation:

  • Verunreinigungsfreie induzierte Eisbildung mittels Laser
  • Peltier Electrofreezing unter Verwendung eines Einfrierapparats mit kontrollierten Kühlraten
  • Induzierte Eisbildung mittels Ultraschall
  • Gerät zur cold spot ice nukleation (mit dem Kryomikroskop)

 

 

Sichere und gering toxische Kryokonservierung

Trotz der Popularität der Kryokonservierung in industriellen, klinischen und akademischen Anwendungsbereichen sind sowohl die Auswirkungen der Kryokonservierung auf subzelluläre Wechselwirkungen als auch auf epigenetische Mechanismen bislang noch nicht eindeutig charakterisiert worden. In früheren Arbeiten am Institut konnte gezeigt werden, dass DMSO das genetische und epigenetische Profil der Zellen beeinflusst. Zudem treten diese Veränderungen nicht zwingend direkt nach dem Auftauen auf, sie könnten auch eine Langzeitwirkung besitzen. Um die ungewünschten Einflüsse der CPA zu reduzierenn, haben wir uns diesbezüglich folgende Schwerpunkte gesetzt:

  • Neuen CPA-Mischungen eine Senkung der DMSO-Konzentration erreichen
  • Serumfreie Kryokonservierung
  • Zellschutz durch Alginat-Kapseln

 

 

Physische und biologische Aspekte der Kryokonservierung

Die Effektivität der optimalen Einfrierprotokolle ist von zellspezifischen physischen und biologischen Parametern abhängig , dem Zellzyklus und -alter, der Membranpermeabilität, der Interaktion der CPAs mit der Zellmembran und mit Wasser sowie von der Osmolalität der kryoprotektiven Lösungen. In diesem Zusammenghang untersuchen wir die folgenden Aspekte:

  • Wärme- und Massentransport
  • Zellantwort auf CPAs und niedrige Temperaturen: Analyse der Membranpermeabilität (Kryomikroskop), osmotischer Druck (Osmomat)
  • Epigenetische und genetische Stabilität

 

 

Kryokonservierung von Blut

Außerdem engagieren wir uns in den folgenden Projekten:

  • Enticklung und Etablierung einer Methode der Kryokonservierung für tierische Erythrozyten zur Einrichtung von Blutbanken für Nutz- und Kleintiere
  • Entwicklung eines automatischen Einfrierapparats für menschliche Erythrozyten

 

 

Geräte zur Untersuchung der Vitalität und Funktionalität

  • Microplate Reader Multiscan EX
  • Cell viability Analyzer Beckman Coulter Vi-Cell XR
  • Particle counter and cell volume analyser Beckman Coulter Counter Multisizer 3
  • Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 510 Meta
  • Fluorescent Microscope Zeiss Axiovert 200M with temperature and humidity controlled incubator

 

 

Neueste Publikationen der Gruppe (aus den letzten drei Jahren)

[1] A. Chatterjee, D. Saha, H. Niemann, O. Gryshkov, B. Glasmacher, N. Hofmann. Effects of cryopreservation on the epigenetic profile of cells. Cryobiology 2016, in press, doi: 10.1016/j.cryobiol.2016.12.002.

[2] L. Lauterboeck, W.F. Wolkers, B. Glasmacher. Cryobiological parameters of multipotent stromal cells obtained from different sources. Cryobiology 2016, in press, doi: 10.1016/j.cryobiol.2016.11.009.

[3] L. Lauterboeck, D. Saha, A. Chatterjee, N. Hofmann, B. Glasmacher. Xeno-free cryopreservation of bone marrow derived multipotent stromal cells from Callithrix jacchus. Biopreservation and Biobanking 2016, accepted, September, in press, doi: 10.1089/bio.2016.0038

[4] A. Chatterjee, D. Saha, B. Glasmacher, N. Hofmann. Chilling without regrets: Deciphering the effects of cryopreservation on the epigenetic properties of frozen cells will benefit the applications of cryo-technology. EMBO Reports 2016;17: 292–295.

[5] A. Repanas, L. Lauterboeck, D. Marvilas, B. Glasmacher. Polycaprolactone and polycaprolactone/ chitosan electrospun scaffolds for tissue engineering applications. Sch. J. App. Med. Sci. 2016, 4(1C): 228-232.

[6] O. Gryshkov, N. Hofmann, L. Lauterboeck, D. Pogozhykh, T. Mueller, B. Glasmacher. Multipotent Stromal Cells Derived from Common Marmoset Callithrix Jacchus within Alginate 3D Environment: Effect of Cryopreservation Procedures. Cryobiology 2015:71(1): 103-111.

[7] L. Lauterboeck, N. Hofmann, T. Mueller, B. Glasmacher. Active control of the nucleation temperature enhances freezing survival of multipotent mesenchymal stromal cells. Cryobiology 2015; 17(3): 384–390.

[8] N. Hofmann, H. Sun, A. Chatterjee, D. Saha, B. Glasmacher. Thermal Pretreatment Improves Viability of Cryopreserved Human Endothelial Cells. Biopreservation Biobanking 2015;13: 348–355.

[9] O. Gryshkov, D. Pogozhykh, N. Hofmann, O. Pogozhykh, T. Mueller, B. Glasmacher. Encapsulating Non-Human Primate Multipotent Stromal Cells in Alginate via High Voltage for Cell-Based Therapies and Cryopreservation. PLoS One 2014;9(9): e107911.

[10] O. Gryshkov, D. Pogozhykh, N. Hofmann, N. Hofmann, T. Mueller, B. Glasmacher. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Mater Sci Eng C 2014;36: 77-83.